通過(guò)篩選天然與人工合成的融合體，在小鼠與斑馬魚幼蟲身上成功得到以為靶點(diǎn)的致密神經(jīng)回路報(bào)告，報(bào)告顯示來(lái)自神經(jīng)纖維的偽信號(hào)明顯減少，信噪比增加，神經(jīng)元之間的偽影相關(guān)性降低。這些結(jié)果均說(shuō)明GCaMP6f和GCaMP7f的細(xì)胞體靶向變體（Soma-GCaMP6f，Soma-GCaMP7f）對(duì)提高單光子熒光成像技術(shù)的精細(xì)性起到著重要作用。這種胞體靶向突變體對(duì)提高神經(jīng)信號(hào)標(biāo)記的精細(xì)性是否具有組織特異性或物種特異性呢？研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)這一問題，分別在小鼠不同腦區(qū)以及斑馬魚幼魚的整胚轉(zhuǎn)染和斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期的信號(hào)采集等方面進(jìn)行研究。小鼠頭戴式微型顯微鏡為后續(xù)清醒動(dòng)物腦功能鈣成像研究提供了一套可靠的顯微成像系統(tǒng)。南京光遺傳鈣成像采購(gòu)信息

目前可用的指示劑較多，根據(jù)熒光光譜、與鈣離子親和力及其化學(xué)特性的不同大致分為化學(xué)性鈣離子指示劑和基因編碼鈣離子指示劑。前者指可特異性與鈣離子結(jié)合的小分子，常用的有fura-2、indo-1等；而后者主要指來(lái)源于綠色熒光蛋白GFP及其變異體的蛋白質(zhì)，可與鈣調(diào)蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶M13域結(jié)合，常用的有GCaMP、TN-XXL等，其中GCaMP5G和GCaMP6被廣泛應(yīng)用于在體鈣成像研究中。生物熒光蛋白：Aequorin是水母熒光素（coelenterazine）通過(guò)硫酸酯鍵或過(guò)氧化鍵緊緊連到脫輔水母發(fā)光蛋白上形成的，遇到鈣離子就發(fā)出470nm藍(lán)光，可以作為鈣離子的檢測(cè)試劑；化學(xué)鈣離子指示劑：Fura-2可在紫外光下被jihuo且發(fā)射出505-520nm光；基于FRET的基因編碼的鈣指示劑；單個(gè)熒光基因編碼的鈣指示劑。哈爾濱inscopix鈣成像什么價(jià)格清醒動(dòng)物腦功能鈣成像的微型顯微鏡的研究在不斷實(shí)踐中。

在神經(jīng)系統(tǒng)研究中，我們常使用鈣指示劑表征鈣離子濃度變化，以反映神經(jīng)元的活動(dòng)。常見的鈣成像方法有雙光子熒光成像和單光子熒光成像兩種，其中后者是研究腦神經(jīng)活動(dòng)的常用方法。但與雙光子成像相比，單光子成像更易受到來(lái)自神經(jīng)元的高水平串?dāng)_，導(dǎo)致信噪比降低。不僅如此，采集活動(dòng)信號(hào)時(shí)還易被來(lái)自近距離通過(guò)的軸突和樹突的信號(hào)所污染，造成的非特異性信號(hào)，這些均嚴(yán)重影響對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)反應(yīng)的精細(xì)成像。因而，在單光子熒光成像的基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)在細(xì)胞核中表達(dá)遺傳編碼的鈣指示劑，從而消除神經(jīng)纖維信號(hào)。但與經(jīng)典的胞質(zhì)鈣成像相比，鈣進(jìn)入細(xì)胞核的要求降低了這種成像的時(shí)間精度。

利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動(dòng)，隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號(hào)和生理現(xiàn)象耦合起來(lái)——通過(guò)熒光染料信號(hào)的改變反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，以此細(xì)胞的功能狀態(tài)。目前它被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，從而判斷其功能活動(dòng)。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號(hào)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時(shí)間和空間上的傳遞穿梭。進(jìn)行鈣測(cè)定必須借助外界的某種可視化物質(zhì)作為它的標(biāo)志物。

可見光激發(fā)Ca2+熒光探針：與紫外光激發(fā)探針相比，可見光激發(fā)Ca2+探針具有更強(qiáng)的染料吸收性能，對(duì)Ca2+變化水平檢測(cè)敏感度也更高，能夠降低對(duì)活細(xì)胞的光毒性和樣品自發(fā)熒光以及光散射的干擾，且無(wú)光譜偏移。較常使用的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針有Fluo-3，F(xiàn)luo-4，Rhod-2等，同時(shí)他們也都是非比率型指示劑。Fluo-3是較常用的可見光激發(fā)Ca2+熒光指示劑之一，是典型的的單波長(zhǎng)指示劑，比較大激發(fā)波長(zhǎng)為506nm，比較大發(fā)射波長(zhǎng)為526nm。它與Ca2+結(jié)合之前幾乎無(wú)熒光，結(jié)合后熒光會(huì)增加60至100倍，從而避免了細(xì)胞自身的熒光干擾。實(shí)際檢測(cè)時(shí)推薦使用的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)為525～530nm（圖3）。Fluo-3可以用在激光共聚焦顯微成像或流式細(xì)胞儀中。它還有一個(gè)升級(jí)版本Fluo-4，在相同Ca2+濃度下信號(hào)更強(qiáng)。鈣信號(hào)在神經(jīng)元功能調(diào)控及信息傳遞方面發(fā)揮著重要作用。超微顯微鈣成像nVoke2.0

鈣成像技術(shù)（calcium imaging）是指利用鈣離子指示劑監(jiān)測(cè)組織內(nèi)鈣離子濃度的方法。南京光遺傳鈣成像采購(gòu)信息

單光子顯微技術(shù)是較成熟的熒光顯微技術(shù)，但由于其使用的激發(fā)光波長(zhǎng)較短，成像深度有限；能量較大,會(huì)造成對(duì)熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實(shí)現(xiàn)樣本三維成像要逐點(diǎn)掃描,成像速度慢,對(duì)樣本損害大,很難用于長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像。而寬場(chǎng)顯微鏡能夠很好地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，但寬場(chǎng)顯微鏡由于離焦信號(hào)的干擾,難以實(shí)現(xiàn)多維成像。Derrick想重點(diǎn)介紹一下較為常用的觀察設(shè)備——雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學(xué)成像方法,采用長(zhǎng)波激發(fā)，能對(duì)組織進(jìn)行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長(zhǎng)大多位于800-900nm，而水、血液和固有組織發(fā)色團(tuán)對(duì)這個(gè)波段的光吸收率低，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第，光損傷小，適用于在體檢測(cè)。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)置入的微電極位置，從而觀察胞體、樹突甚至單個(gè)樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細(xì)胞單個(gè)樹突棘中的鈣分布。南京光遺傳鈣成像采購(gòu)信息

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