膜片鉗技術基本原理與特點:膜片鉗技術本質上也屬于電壓鉗范疇,兩者的區(qū)別關鍵在于:①膜電位固定的方法不同;②電位固定的細胞膜面積不同,進而所研究的離子通道數目不同。電壓鉗技術主要是通過保持細胞跨膜電位不變,并迅速控制其數值,以觀察在不同膜電位條件下膜電流情況。因...
Real-time PCR探針法適用于:1、具有高適應性和可靠性,實驗結果穩(wěn)定重複性好,特異性更高。2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。4、靶基因的特異序列較短,無論怎樣較佳化引物設計條件都不能解決。5、存在與靶基因同...
膜片鉗使用的注意事項:1.為了防止塵埃、靜電傷害機器,每天做實驗前請用清水拖地。2.拉制儀使用前需預熱15-30min。3.銀絲電極及地線發(fā)白時,請先用砂紙輕微打磨,再浸入新鮮的次氯酸鈉溶液鍍氯化銀,如果銀絲電極30min未變黑,則考慮更換次氯酸鈉。4.先開放...
膜片鉗電生理記錄技術:膜片鉗技術的基本原理:膜片鉗技術用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面,使之形成10~100MΩ的高阻封接,被孤立的小膜片面積為微米數量級,因此封接范圍內細胞膜光有少數離子通道。然后對該膜片實行電壓鉗位,測量單個離子通道開放產生的微小電流,這種...
膜片鉗使用的注意事項:工作原理膜片鉗是一種能夠直接觀察單一的離子通道蛋白質分子對相應離子通透難易程度等特性的一種實驗技術。它的基本原理是以一個光潔,直徑約為0.5~3um的玻璃微電極同神經或肌細胞的膜接觸,之后對微電極另一端開口處施加適當的負壓用電極的纖細開口...
膜片鉗使用的基本方法是,把經過加熱拋光的玻璃微電極在液壓推進器的操縱下,與清潔處理過的細胞膜形成高阻抗封接,導致電極內膜片與電極外的膜在電學上和化學上隔離起來,由于電性能隔離與微電極的相對低電阻(1~5MΩ),只要對微電極施以電壓就能對膜片進行鉗制,從微電極引...
Real-time PCR鏈反應的常見問題分析與解決方法:反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。引物量過多。減少反應體系中引物的用量。模板量過多。質粒DNA的用量應
膜片鉗電生理技術服務只適用于藥物的初篩和二次篩選,且對樣本有很高的選擇性,而傳統(tǒng)的膜片鉗技術可適用于各種樣本,應用范圍廣,能夠分析檢測所有的離子通道類型,同時能夠分析離子通道的動力學特征。因此目前,傳統(tǒng)膜片鉗技術仍然是不可替代的。在進行膜片鉗實驗時,玻璃電極給...
膜片鉗技術是一種記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜上離子通道分子活動的技術。是用來研究單個離體的活細胞、組織切片或細胞膜片離子流的電生理實驗技術。這項技術在可興奮細胞如神經元、心肌細胞、肌纖維和胰腺細胞的研究中起至關重要的作用,也可用于研究特殊制備的巨型球...
為了便于對所檢測樣本進行比較,在real-timeQ-PCR反應的指數期,首先需設定一定熒光信號的域值,一般這個域值(threshold)是以PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號(baseline),熒光域值的缺省設置是3~15個循環(huán)的熒光信號的...
膜片鉗實驗常見問題及解決方法:膜片鉗技術是電生理記錄的常用手段,目前在科學研究中使用越來越普遍。但在具體膜片鉗實驗操作的過程中,總會遇到各種各樣的問題,對實驗人員造成很多困擾。本次講座主要從實驗角度出發(fā),以簡單,實用的原則,著重講解實驗中遇到的各種問題,以及解...
引物的設計對于這個實驗至關重要,因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高,所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道,還有幾點必須注意:1,引物的錯配率(引物錯配形成引物二聚體,但是SYBR照樣能嵌入進去,結果導致實驗結果的誤差很大,重...
Real-time PCR實驗常用的RNA酶抑制劑:1.焦磷酸二乙酯(DEPC):是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性,從而抑制酶的活性。2.異硫氰酸胍:目前被認為是較有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的...
膜片鉗實驗的細胞膜型:一個完整的細胞膜電學模型包含幾個基本組分:膜電容,膜電阻和膜電勢。這三個電學組分形成的原因各不相同:1、膜電容(membranecapacitance,Cm)的形成是由于生物膜為磷脂雙分子層,對離子和其他水溶性物質均不通透,遂使細胞膜成為...
膜片鉗記錄的幾種形式:細胞吸附膜片(cell-attachedpatch)將兩次拉制后經加熱拋光的微管電極置于清潔的細胞膜表面上,形成高阻封接,在細胞膜表面隔離出一小片膜,既而通過微管電極對膜片進行電壓鉗制,高分辨測量膜電流,稱為細胞貼附膜片。由于不破壞細胞的...
膜片鉗實驗系統(tǒng):根據不同的電生理實驗要求,可以組建不同的實驗系統(tǒng),但有若干共同的基本部件,包括機械部分(防震工作臺、屏蔽罩、儀器設備架)、光學部分(顯微鏡、視頻監(jiān)視器、單色光系統(tǒng))、電子部件(膜片鉗放大器、刺激器、數據采集的設備、計算機系統(tǒng))和微操縱器在大多數...
Real-time PCR鏈反應:嵌套聚合酶鏈反應:通過減少DNA非特異性擴增的背景,提高DNA擴增的特異性。兩組引物用于兩個連續(xù)的PCR。在個反應中,一對引物用于產生DNA產物,除了預期的靶之外,該產物可能仍然由非特異性擴增的DN段組成。然后用一組引物將產物...
膜片鉗操作實驗:膜片鉗放大器是整個實驗系統(tǒng)中的中心,它可用來作單通道或全細胞記錄,其工作模式可以是電壓鉗,也可以是電流鉗。從原理來說,膜片鉗放大器的探頭電路即I-V變換器有兩種基本結構形式,即電阻反饋式和電容反饋式,前者是一種典型的結構,后者因用反饋電容取代了...
國際上流行的【血清融化三步法】可較為大限度地保存血清中因子的活性,不會產生沉淀,同時能縮短血清融化時間。關于胎牛血清的滅活:真正的胎牛血清因為胎牛沒有形成有效補體,如果針對補體滅活的話,就不需要。其他情況根據實驗設計來決定。胎牛血清的濃度:胎牛血清通常是以2%...
為何血清會存在批間差?如何避免此影響?因為血清來源于動物,其組成成分有1000種左右,每個批號的組分和組分含量都是不固定的,因此批間差異是可能存在的。為了避免批間差異對細胞的影響,XP建議先進行批號測試,篩選合適的批號,備好庫存(血清未開封時,在-20℃下可保...
很好的胎牛血清:好的血清應是透明清亮,土黃色或棕黃色,無沉淀或極少沉淀,比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁,不透明,含許多沉淀物,說明血清污染或血清中的蛋白質變性;若棕紅色,說明血清中的血紅蛋白含量太高,有溶血現(xiàn)象。胎牛血清一般范圍是30-40mg/ml,數值偏高,說明...
血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物,其組成成份雖大部分已知,但還有一部分尚不清楚,且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、、無機物等,這些物質對促進細胞生長...
胎牛顧名思義就是指還在母牛身體里的小牛,所以胎牛血清的采集工作,便是先從懷孕中的母牛身體里取出胎牛(通常5-8個月胎齡),之后對未發(fā)育完全的胎牛的心臟穿刺取血,完成的工作以后便再通過一系列的工藝處理獲得胎牛血清。而新生牛血清主要是采集已出生10天內的小牛,而且...
胎牛血清是一種性狀、外觀 淺黃色澄清、無溶血、無異物稍粘稠液體。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛;新牛血清取自出生24小時之內的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。顯然,胎牛血清是品質較為高的,因為胎牛還未接觸外界,血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分較...
熱滅活:一般是以56℃,30分鐘來處理已解凍的血清,因為此加熱步驟,可以使補體去活化,而補體所參與的反應有:溶細胞活性,平滑肌的收縮,肥大細胞和血小板組胺的釋放,增強吞噬作用,淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和。有必要做熱滅活嗎?實驗顯示,經過正確處理的熱滅清,對大多...
胎牛血清和新生牛血清的區(qū)別是什么?取血年齡不同:牛血清按照牛取血時間或牛齡可進行區(qū)分。胎牛血清指的是取自未出生,母牛剖腹得來的胎牛。國產胎牛血清(并無明確定義,但通常以此稱)的指的是出生4-6小時,且未進行哺乳進食的牛,有時還稱作國產新生牛。 新生牛血清指的是...
很好的胎牛血清:微生物,包括細菌、霉菌、支原體、噬菌體、各類病原毒等。隨著國內血清廠家生產條件的改善提高,細菌、霉菌等“大型”微生物幾乎能100%控制,支原體經過0.1μm過濾,大多也能消除。大腸桿菌噬菌體的污染還是比較嚴重的,主要是生產環(huán)境過程中帶入,又無法...
較為低血清試驗的要求。內有毒的檢測:內有毒的,又叫脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS),存在于革蘭氏陰性菌的細胞外膜。臨床上,內有毒的作為一些革蘭氏陰性菌的診斷提示,如腦膜炎球菌。動物體內,內有毒的能夠導致發(fā)熱或者誘導炎癥反應;細胞培養(yǎng)中,內有毒的能夠誘導細胞反...
國內科研人員購買胎牛血清的現(xiàn)狀:難辨真假。 原因很多,一方面是國內血清市場這幾年是愈發(fā)的混亂了,很多商家都盯上了這塊“蛋糕”,現(xiàn)在國內市場能見到的各種來源的血清品牌大于50種,使用者在不了解國家政策和相關知識的前提下很難去辨別和選擇安全、穩(wěn)定、合規(guī)的胎牛血清。...
血清的保存應該注意:熱滅活是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻,此熱處理的目的是使血清中的補體成分(complement)滅活,除非必須,一般不建議作此熱處理,因為熱處理會造成血清沉淀物明顯增多,而且還會影響血清的質量,補體參與反...