影響物理轉染或機械轉染效率的因素在很大程度上取決于這些方法的基本原理。例如，電穿孔技術依賴于電場來增加宿主細胞膜的通透性，以內化外來核酸。因此，電穿孔過程中的電壓和持續(xù)時間是決定電穿孔成功與否的重要因素。施加高壓的長時間電穿孔可能會導致細胞損傷并降低轉染效率。通過增加電脈沖的數(shù)量也可以提高電轉染效率，但這可能會降低細胞活力。另一方面，電轉染效率取決于所使用的細胞類型，每當要電轉染一種新的細胞類型時，應優(yōu)化電穿孔條件。一些細胞如T淋巴細胞，即使在標準的電穿孔條件下也可能轉染不良，而電轉染成纖維細胞通?？梢援a(chǎn)生良好的轉染結果。電穿孔緩沖液的組成是影響轉染效率的另一個關鍵參數(shù)。據(jù)報道，電穿孔緩沖液中的ATP酶抑制劑如利多卡因可提高電穿孔后的細胞活力，而使用K+-based緩沖液的轉染效率優(yōu)于Mg2+-based緩沖液。假設Mg2+離子在***ATP酶以恢復電穿孔后的離子穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用，以比較大限度地減少細胞死亡，但可能會降低轉染效率。因此，應優(yōu)化由多種成分組成的合適的電穿孔緩沖液配方，以確保轉染效率和電穿孔后細胞活力之間的平衡。南京星葉生物正是利用將核酸封裝在納米級脂質體囊泡中的技術，開發(fā)出了Gemate系列轉染試劑。內蒙古成都轉染試劑

選擇合適的轉染試劑可能取決于幾個因素，包括轉染核酸的類型和轉染的復雜性(單轉染或共轉染)。一些試劑如Effectene和TransIT-X2是專門用于質粒DNA轉染的，而一些試劑如Lipofectamine RNAiMAX更適合于小寡核苷酸的轉染。哺乳動物原代細胞由于其有限的壽命和有限的擴增能力，通常比其他細胞類型更不容易受到轉染。非脂質體試劑在轉染人原代細胞方面優(yōu)于脂質體試劑，包括PEC、HASMC和HAEC、人原代成肌細胞和AGS。相比之下，據(jù)報道，基于脂質體的試劑(如Lipofectamine和DharmaFECT家族)在轉染其他原代人細胞(如原代臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)和BM-MSC方面比非脂質體試劑產(chǎn)生更高的轉染效率。廣西jetPEI 轉染試劑用二乙基氨基乙基修飾，右旋糖酐鏈的酰胺化很容易被質子化，這使得它可以自組裝成帶負電荷核酸的納米顆粒。

基于病毒的轉染，或者更具體地稱為轉導，涉及使用病毒載體將特定的核酸序列帶入宿主細胞。逆轉錄病毒，如慢病毒，通常用于穩(wěn)定轉染。相比之下，腺病毒、腺相關病毒(AAV)和皰疹病毒是不能保證穩(wěn)定轉染的病毒載體。與非病毒轉染相比，病毒轉導被***認為是一種轉染難以轉染的細胞(如原代細胞)的高效方法。一般來說，逆轉錄病毒只能用于轉染分裂細胞，而腺病毒、AAV和皰疹病毒可用于轉染分裂細胞和非分裂細胞。然而，病毒轉導與較高的細胞毒性相關，并可能造成病毒***的風險。病毒載體通常包含一個病毒包膜，它包圍并保護病毒。表面蛋白可能存在于某些類型的病毒(如腺病毒)的表面，以促進與宿主細胞的接觸和通信。病毒遺傳物質被包裹在衣殼中，進入宿主細胞后，衣殼將被打開。與腺病毒、aav和皰疹病毒的基因組不同，這些病毒的基因組是單獨維持的，逆轉錄病毒基因組被整合到宿主基因組中。通常，腺病毒和皰疹病毒攜帶雙鏈DNA, AAV攜帶單鏈DNA，而逆轉錄病毒攜帶RNA。

小RNA和質粒DNA的共轉染可用于評估轉染效率。這可以通過引入含有熒光素酶報告基因的質粒來實現(xiàn)，其中的3'UTR可以被特定的小RNA(如miRNA)識別，然后允許小RNA結合以抑制熒光素酶的表達。另一方面，在RNA干擾(RNAi)研究中，小RNA和質粒DNA的共轉染也是必不可少的，以確定siRNA等特定小RNA對宿主細胞中特定基因表達的調節(jié)作用。小的非編碼RNA，如siRNA，以其表觀遺傳調控能力而聞名，更具體地說，是轉錄后對特定基因表達的調控。siRNA模擬物和攜帶與熒光素酶報告系統(tǒng)相關的特定基因的質粒DNA可以同時共轉染到靶細胞中。siRNA模擬物成功敲低特定基因表達將導致熒光素酶活性***降低。共轉染還可能涉及不同的小分子如miRNAs，這有助于研究小RNA對靶宿主細胞的影響。例如，如果引入miRNA模擬物可以影響特定細胞類型中特定下游基因的表達，那么預計將其抑制劑序列同時轉染到同一細胞中會降低單獨miRNA模擬物序列發(fā)揮的轉錄后調節(jié)作用。與單一核酸類型的轉染相比，涉及將多個核酸轉移到同一細胞中的共轉染通常更多挑戰(zhàn)性更大，因為并非所有核酸類型都能有效轉移，這可能取決于轉染方法和所涉及的細胞類型。由于CRISPR/Cas的發(fā)現(xiàn)，基因組編輯領域經(jīng)歷了一場變革。

評估轉染效率至關重要，特別是在需要高轉染效率以保證特定下游靶標轉錄后調控的功能研究中?？梢赃x擇多種策略來評估轉染效率。實時聚合酶鏈反應(qPCR)是一種通過直接測量特定外源蛋白表達水平來評估轉染效率的定量方法。細胞內核酸或其他可能受到外源核酸(如miRNAs)影響的細胞內核酸。在瞬時轉染的情況下，每次轉染后都應進行qPCR，以確保良好的轉染效率，然后再進行下游實驗。與質粒報告系統(tǒng)共轉染是另一種策略，可以通過表達特定的報告蛋白(如熒光素酶或β-半乳糖苷酶)來評估轉染效率。采用小RNA熒光素酶報告系統(tǒng)以干擾(RNAi)研究為例，miRNA轉染成功的標志是熒光素酶活性下調，這是由于miRNA與轉錄的熒光素酶mRNA 3'端結合導致mRNA降解。熒光顯微鏡是評估轉染效率的另一種常見、簡便、快速的方法。它通常涉及使用攜帶熒光報告基因或標記有熒光團的寡核苷酸的載體來進行熒光檢測。然而，熒光顯微鏡只能提供對轉染效率的定性或半定量測量，這可以使用ImageJ等專門軟件來確定。肌內注射脂質體不能引起強烈的毒性反應，這與肺內或靜脈注射途徑的情況不同。上海轉染試劑檢測

陽離子脂質體合成中常用的分子是中性脂質二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。內蒙古成都轉染試劑

在轉染中，DNA通常通過病毒或非病毒載體(如質粒)轉運到宿主細胞中。質粒的基本結構包括啟動子、復制起點、多個克隆位點、目標基因和選擇標記。質粒復制需要復制的起源，而多個克隆位點包含獨特的內切酶切割位點，用于插入外源基因。適當?shù)恼婧藛幼?如CMV或EF-1a)的存在允許外源基因在宿主細胞中表達。質粒DNA可以以線性和超螺旋DNA的形式轉染。與線性DNA相比，使用超螺旋質粒DNA轉染通常會產(chǎn)生更高的效率，線性DNA更容易被外切酶降解。然而，線性化的DNA更具重組性，因此可以更容易地整合到宿主基因組中以實現(xiàn)穩(wěn)定的轉染。內蒙古成都轉染試劑